产生具有所需线粒体dna（mtdna）序列的哺乳动物细胞有助于研究线粒体、疾病建模和潜在的再生疗法。美国研究人员alexander n. patananan等开发了一种高通量线粒体转移装置——mitopunch，通过将小鼠或人类细胞分离出的线粒体转移到原代或永生的mtdna缺陷（ρ0）细胞中，产生具有特定mtdna-ndna （核dna）组合的细胞。稳定的分离线粒体受体（stable isolated mitochondrial recipient, simr）细胞经限制性培养基分离，能够yongjiu保留供体mtdna并重新获得呼吸作用。然而，尽管在限制性培养基中生长，simr成纤维细胞仍保持ρ0样细胞代谢组和转录组。研究人员将非永生的simr成纤维细胞重新编程为诱导多能干细胞（ipsc），随后分化为多种功能细胞类型，包括间充质干细胞（msc）、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。重编程和分化后，simr成纤维细胞在分子和表型上与对照成纤维细胞类似。因此，使用mitopunch能够生产具有dute mtdna-ndna组合的simr细胞，可用于多种细胞类型的研究和应用。文章以“pressure-driven mitochondrial transfer pipeline generates mammalian cellsof desired genetic combinations and fates”为题发表于cell reports。
介绍
哺乳动物线粒体是细胞的动力工厂，在细胞凋亡、活性氧（ros）和fe-s簇生成、ca2+调节、代谢物产生方面有辅助作用。每个线粒体含超过1,100个由细胞核编码并导入的蛋白质，其中大量拷贝为圆形约16.5 kbp的线粒体基因组（mtdna），编码13种电子传递链（etc）和呼吸所需的蛋白质。多达1:5,000的人存在mtdna突变，这种突变会损害高能量需求组织并引发衰竭性疾病，包括癌症、糖尿病和代谢综合征。此外，细胞可能包含不同mtdna序列的混合物，这种情况被称为异源性（heteroplasmy），多达1/8的无症状个体携带未知的致病性mtdna突变。因此可控操纵mtdna序列可以实现对线粒体的研究，并有可能开发mtdna病的疾病模型或疗法。
在人类生殖领域已有几种线粒体替换策略，可将受精卵中的致病mtdna与健康供体卵母细胞中的无害mtdna交换。这些方法有望防止mtdna异常从携带者母亲传染给其子女。然而体外改变体细胞和组织内mtdna序列的方法仍存在一定限制。细胞融合产生的“胞质杂合体（cybrids）”能够yongjiu保留供体线粒体。此外导入线粒体的核酸内切酶可以通过靶向特定序列进行破坏，从而改变异质比率来改变线粒体和细胞功能。但这些核酸内切酶生产过于费力、局限于某些mtdna序列、效率低，并且产物不同质。使用细菌胞苷脱氨酶（ddda）可编辑mtdna单碱基序列，但效率低且脱靶率令其不尽如人意。
目前有几种方法可将分离的线粒体转移到mtdna缺陷细胞[称为ρ0 (rho null)细胞]中，以恢复呼吸作用。此外还有研究报道了哺乳动物细胞对线粒体的内吞作用。然而这些研究的重点并不是挽救ρ0细胞及产生能够yongjiu保留供体mtdna的，稳定的分离线粒体受体（stable isolated mitochondrial recipient, simr）克隆。有研究通过将高浓度的分离的供体hek293t线粒体与ρ0骨肉瘤细胞共培养，产生了数量有限的simr克隆。类似的还有细胞能够内吞外源线粒体，甚至在有限的时间内（约1周）改变代谢功能，但这些外源mtdnas会随时间的推移而丢失。光热纳米叶片可解决这个问题，稳定地将少量分离的线粒体转移到ρ0骨肉瘤细胞中。但纳米刀片费时费力且产量低，三个simr克隆中有两个改变了ρ0细胞代谢组。因此需要能够产生大量非转化的稳定克隆的新技术，以通过重编程产生多能性并分化为多种细胞类型来研究不同mtdna-ndna（核dna）组合。
本文描述了一种简单易用的线粒体转移技术，称为“mitopunch”，以快速生成大量未转化的simr克隆。应用mitopunch进行了一套“流水线”试验，证明了供体mtdna在不同细胞命运下的受体宿主原代细胞中具有功能。借由本研究建立的方法，利用非永生化材料产生了原代simr细胞。还以确定的mtdna-ndna组合测量了simr细胞的代谢组学、转录组学和生物物理性质状态，对将来产生具有所需的mtdna-ndna组合的体细胞的研究具有指导作用。
结果
01-mitopunch产生不同细胞类型和mtdna的simr细胞
mitopunch是一个基于光热纳米刀片和生物光子激光辅助细胞手术工具（biophotonic laser-assisted cell surgery tool, blast）技术的大规模并行、压力驱动的大型转运平台。mitopunch使用机械柱塞使柔韧的聚二甲基硅氧烷（pdms）储器发生物理变形，储器中含1×pbs（ph 7.4）分离的线粒体悬浮液（图1a）。柱塞驱动推动pdms输送室中的悬浮物通过多孔膜，多孔膜包含许多直径3μm的孔，生长有一层粘附细胞。这种作用直接迫使分离的线粒体进入受体细胞的胞质溶胶。
为证实mitopunch能够产生simr细胞，将分离自约1.5 × 107个hek293t细胞的线粒体转移至约2 × 105个143btk-ρ0骨肉瘤细胞中。转移后使用尿苷缺乏培养基选择并分离能够yongjiu保留供体mtdna的simr克隆。由于呼吸缺陷型ρ0细胞具有无活性的二氢硼酸脱氢酶，并且依赖外源尿苷或恢复呼吸来进行嘧啶生物合成，因此这种筛选是可行的。对比同数量线粒体与细胞的共孵育实验，只有mitopunch产生的带有hek293t线粒体的143btk-ρ0细胞（143btk-ρ0+hek293t）yongjiu保留了供体mtdna，并在尿苷缺乏的培养基选择中存活（图1b）。在一组有代表性的线粒体转移实验中，mitopunch产生了约75个独立的结晶紫染色的simr克隆，相比之下共孵育没有获得克隆（图1b）。
接下来研究mitopunch否能产生带有明确mtdna-ndna对（能够传递线粒体疾病特征）的simr克隆。线粒体分别来自含a3243g mtdna替代物的胞质杂合体，该突变常与线粒体脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作（melas）相关，以及同一个体野生型（wt）细胞。已知a3243g点突变位于trnaleu基因，会导致etc复合物的产生和组装发生改变，使氧化磷酸化受损。mitopunch将线粒体导入143btk-ρ0受体细胞并选择培养2周后，获得数十个yongjiu保留melas（143btk-ρ0+melas）或wt（143btk-ρ0+wt） mtnda的独立simr克隆，用seahorse extracellular flux analyzer测试其中2个克隆的耗氧率（ocr）。结果显示与患者匹配的143btk-ρ0+wt和天然143btk对照细胞相比，143btk-ρ0+melas克隆的基础呼吸、zuida呼吸和备用呼吸能力显著受损（图1c ），表明melas表型的主要代谢缺陷已通过的稳定mtdna转移实现。
扩大线粒体供体和受体细胞配对范围，以证明mitopunch的多功能性。从c57bl/6小鼠组织中分离线粒体，mitopunch将其转移到c3h/an衍生的l929 ρ0永生化成纤维细胞中。选择两周后每个线粒体来源产生了几十个simr克隆。相较于接受了低能量需求的脾或shenyuan线粒体的simr克隆来讲，接受高能量需求的心脏、肺或肌肉源线粒体产生的simr克隆显示出zuiqiang健的呼吸特征（图1d）。还评估了用mitopunch将异质mtdna混合物导入细胞。选择有mtdna突变的小鼠胞质杂合体系分离线粒体，分别为细胞色素b（mt-cytb）、nadh脱氢酶亚基4（mt-nd4）和nadh脱氢酶亚基6（mt-nd6）基因突变，使用mitopunch将线粒体单独或与蛋白1:1比例转移到l929 ρ0成纤维细胞中。具有单一突变mtdna源的simr细胞继续表现出严重的呼吸损伤（图1e）。而含有非重叠突变线粒体基因的simr细胞显示出明显改善的呼吸特征，有力表明两种线粒体基因都得到稳定保留（图1e）。因此mitopunch和细胞筛选可作为一种通用方法，来产生具有所需mtdna-ndna对的人或小鼠simr细胞。将多种类型的mtdna共转移到同一受体细胞中，也可作为检测突变mtdna混合物的互补的一种简单方法。
图1 mitopunch是一种多功能线粒体转移技术。（a）mitopunch线粒体转移平台示意图。（b）共孵育或mitopunch传递，1×pbs（ph7.4）（对照）或hek293t细胞线粒体，转移到143btk-ρ0骨肉瘤细胞中，去尿苷培养基筛选后的结晶紫染色simr克隆。数据为3次技术重复的均值±sd。（c）seahorse xf96 extracellular flux analyzer 测量的ocr，分别为约1.5×104的143btk-、143btk-ρ0、wt cybrid、melas cybrid, 143btk-ρ0+melas simr、143btk-ρ0+wtsimr。数据为4次技术重复的均值±sd。
02-mitopunch产生非转化的非恶性simr细胞